scinquisitor (scinquisitor) wrote,
scinquisitor
scinquisitor

CRISPR/Cas9 и генная инженерия эмбрионов человека

Сейчас все обсуждают новость о том, что в Великобритании разрешили ставить опыты по генетической модификации человеческих эмбрионов (пока без последующего выращивания из них детей). Про эту новость подробно написал образовательный ресурс N+1, поэтому повторять детали события я не буду, а лучше расскажу про саму науку. Про то, как изменились наши возможности редактирования ДНК за последние несколько лет.

Впервые редактирование ДНК эмбриона человека осуществили в прошлом году исследователи из Китая. Для редактирования ДНК использовалась элегантная технология, за которую непременно дадут Нобелевскую премию, – CRISPR/Cas9.

Эту биотехнологию, как это часто бывает, ученые позаимствовали у природы. В данном случае у некоторых бактерий, у которых CRISPR/Cas9 играет важную роль в распознании и уничтожении вирусов. У этих бактерий в ДНК есть что-то вроде пополняемой базы данных фрагментов вирусных последовательностей (очень похоже на то, как работают многие компьютерные антивирусные программы). Бактерии синтезируют многочисленные РНК копии сохраненных вирусных фрагментов, а белок Cas9 использует эти копии для того, чтобы находить настоящих вирусных захватчиков и разрезать их (Рисунок 1), как полиция определяет преступников, сверяясь с фотографиями или отпечатками пальцев.

Молекула РНК, которая указывает белку Cas9 на вирус, который нужно разрезать, называется путеводной (Guide RNA, рисунок 2), а принцип узнавания ужасно прост – это принцип комплементарности, тот же самый, который отвечает за образование двойной спирали в молекуле ДНК, где напротив нуклеотида А всегда стоит нуклеотид Т, а напротив G стоит C (Рисунок 2).

Не составляет труда подсунуть белку Cas9 искусственно спроектированную путеводную РНК, такую, чтобы направить его на разрезание практически любой заданной последовательности ДНК, в том числе и человеческой. Или ДНК вирусов, пытающихся человека заразить. В случае с вирусами – создание разрезов в их ДНК является самоцелью, способом защиты от инфекции. В случае с редактирование ДНК человека или другого организма, точный разрез нужен для последующей точной вставки какого-нибудь полезного гена (Рисунок 3).


Сегодня CRISPR/Cas9 используют для редактирования ДНК разнообразных организмов и даже возникают идеи, что частично пересадив эту систему бактериального иммунитета человеку или другому организму, мы сможем добавить новый уровень защиты от патогенов. В 2015 году в журнале Genome Biology вышла статья, авторы которой перенесли этот механизм иммунитета в растение, родственное табаку, защитив его от некоторых вирусов. Тем временем, на изолированных человеческих клетках было показано, что данный подход, позволяет направленно вырезать встроенные в хромосомы ДНК-копии вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Вполне вероятно, что именно с помощью CRISPR/Cas9 мы когда-нибудь окончательно победим ВИЧ, о чем подробней я рассказываю в книге «Сумма биотехнологии».

В упомянутой работе китайских ученых было отмечено, что часто редактирование ДНК с использованием CRISPR/Cas9 происходило в нежелательных местах, а значит, прежде чем мы сможем создавать генетически модифицированные эмбрионы человека, технологию нужно существенно доработать. Из этических соображений мы не можем допустить, чтобы рождались дети-инвалиды с мутациями, случайно внесенными технологией.

Именно поэтому так важно, что с момента, как китайские ученые начали свое исследование по генной инженерии эмбрионов, наука сильно шагнула вперед и точность редактирования ДНК с использованием CRISPR/Cas9 выросла на порядки.

Как я описывал ранее (в том числе и в книге), появилась статья про новую мутантную форму белка Cas9, в 25 раз более специфичную, чем та, что была исходна обнаружена у бактерий. Кроме того, было найден биохимический метод воздействия на клетки, увеличивающий эффективность редактирования генома с помощью Cas9 в 17 раз. Были обнаружены гены, временно выключая которые, удается повышать эффективность редактирования генома в 8 раз. Еще две группы ученых получили мутантный белок Cas9, который редактирует ДНК только после активации светом, что имеет свои интересные применения.

Но я еще не писал о том, что в этом году в журнале Nature вышла статья, авторы которой утверждают, что разработали вариант Cas9 под названием SpCas9-HF1, который уже совсем не делает ошибок или делает их так мало, что обнаружить их современными методами анализа ДНК затруднительно.

Ранее появились удивительные ухищрения, позволяющие увеличить точность редактирования ДНК с использованием CRISPR/Cas9. При одном из таких подходов ДНК-мишень узнавалась не одним белком Cas9 с направляющей РНК, а одновременно двумя умышленно «испорченными» Cas9 с разными направляющими РНК. Направляющая РНК распознает участок ДНК длиной примерно в 20 нуклеотидов (т.е. букв A, T, G,C), но для разреза не всегда требуется полное совпадение, поэтому в геноме человека, в котором имеется 3 миллиарда нуклеотидов, может случайно найтись несколько участков, похожих на предполагаемое место разреза (что приведет к ошибкам). Упомянутые «испорченные» белки Cas9 не разрезают две цепочки ДНК, как обычно, а только одну из двух, поэтому разрез легко исправляется клеткой и только если два таких белка одновременно узнают два соседних участка ДНК, разрез пройдется по двум цепям (Рисунок 4).


Совсем радикальный метод заключается в том, что белок Cas9 можно «испортить» еще больше, чтобы он вовсе не мог разрезать ДНК, но по-прежнему мог распознавать специфические участки, используя путеводную РНК. К таким испорченным версиям Cas9 с использованием генной инженерии приделываются половинки фермента, который умеет разрезать определенную последовательность ДНК. Теперь для разрезания ДНК необходимо еще больше условий: два белка Cas9 с разными путеводными РНК должны узнать два соседних участка, расположенных на таком фиксированном расстоянии, чтобы две половинки фермента образовали целый фермент, который еще должен узнать специфичное для него место потенциального разреза (Рисунок 5). Случайно такое произойти практически не может.


Скоро мы научимся редактировать ДНК абсолютно точно, с первой попытки и с высокой эффективностью и тогда станет возможным практическое применение генной инженерии для создания генетически модифицированных (дизайнерских) детей. С развитием наших знаний о генетике человека, в будущем можно будет устранять даже малые генетические дефекты, задавать желаемый цвет глаз или волос, улучшать физические и умственные способности людей.

В конце прошлого года в журнале Science была опубликована работа, авторы которой вылечили мышей, страдающих наследственной формой мышечной дистрофии с помощью CRISPR/Cas9. Это еще одно важное применение технологии – генная терапия, позволяющая лечить от генетических заболеваний даже взрослые организмы. Генная терапия имеет применение в лечении не только наследственных заболеваний, но и рака, ведь мы умеем создавать специальные генетически модифицированные клетки иммунной системы, выискивающие клетки некоторых злокачественных опухолей.

Наконец, еще одна группа исследователей получила с помощью Cas9 генетически модифицированные сперматозоиды (пока что крыс). Если нам удастся перенести данную технологию на людей, то мы сможем создавать генетически модифицированное потомство, не вмешиваясь в развитие эмбрионов, что снимет часть этических вопросов.

Все вышесказанное – важнейшие этапы на пути к «автоэволюции», о которой писал писатель, футуролог и фантаст Станислав Лем. Автоэволюция – это когда жестокий, но естественный отбор, двигающий эволюцию путем устранения неприспособленных особей, постепенно заменяется на «разумный замысел», при котором организмы улучшаются без лишних жертв, а еще лучше: при жизни. Мы живем в мире стремительного прогресса, но самое удивительное, что скоро меняться начнем и мы. Пора готовиться!

Прикладываю список научных статей, в которых изложены упомянутые научные открытия:

  1. Pourcel C et al: CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology 2005, 151(Pt 3):653-63.

  2. Mojica FJ et al: Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J Mol Evol 2005, 60(2):174-82.

  3. Bolotin A et al: Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology 2005, 151(Pt 8):2551-61.

  4. Makarova KS et al: A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol Direct 2006, 1:7.

  5. Barrangou R et al: CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 2007, 315(5819):1709-12.

  6. Jinek M et al: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012, 337(6096):816-21.

  7. Jinek M et al: RNA-programmed genome editing in human cells. Elife 2013, 2:e00471.

  8. Wang H et al: One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013, 153(4):910-8.

  9. Liang P et al: CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell 2015, 6(5):363-72.

  10. Ran FA et al: Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell 2013, 154(6):1380-9.

  11. Tsai SQ et al: Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nat Biotechnol 2014, 32(6):569-76.

  12. Guilinger JP et al: Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat Biotechnol 2014, 32(6):577-82.

  13. Davis KM et al: Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nat Chem Biol 2015, 11(5):316-8.

  14. Maruyama T et al: Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat Biotechnol 2015, 33(5):538-42.

  15. Chu VT et al: Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol 2015, 33(5):543-8.

  16. Hemphill J et al: Optical Control of CRISPR/Cas9 Gene Editing. J Am Chem Soc 2015, 137(17):5642-5.

  17. Nihongaki Y et al: Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nat Biotechnol 2015.

  18. Chapman KM et al: Targeted Germline Modifications in Rats Using CRISPR/Cas9 and Spermatogonial Stem Cells. Cell Rep 2015, 10(11):1828-35.

  19. Tebas P et al: Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. N Engl J Med 2014, 370(10):901-10.

  20. Ebina H et al: Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus. Sci Rep 2013, 3:2510.

  21. O'Connell MR et al: Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature 2014, 516(7530):263-6.

  22. Kleinstiver et al: High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature 2016, 529, 490-495.

  23. Nelson et al: In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science, 2015.

  24. Ali et al: CRISPR/Cas9-mediated viral interference in plants. Genome Biol. 2015; 16: 238.

P.S. Приходите на бесплатные лекции про биотехнологии в Москве

Tags: ГМО, биология, обзор
Subscribe
  • Post a new comment

    Error

    Anonymous comments are disabled in this journal

    default userpic
  • 155 comments
Previous
← Ctrl ← Alt
Next
Ctrl → Alt →
Previous
← Ctrl ← Alt
Next
Ctrl → Alt →